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DAPI染DNA的原理及使用方法(包含DAPI配制)

發(fā)布日期: 2016-04-22
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DAPI染DNA的原理及使用方法

DAPI 即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole),分子式為C16H15N5·2C3H6O3 ,分子量457.48。

DAPI是一種能夠與DNA強力結合的熒光染料。它結合到雙鏈DNA小溝的AT堿基對處,一個DAPI分子可以占據(jù)三個堿基對的位置。結合到雙鏈DNA上DAPI分子的熒光強度提高大約20倍,常用與熒光顯微鏡觀測,根據(jù)熒光的強度可以確定DNA的量。另外,因為DAPI可以透過完整的細胞膜,它可以用于活細胞和固定細胞的染色。

在熒光顯微鏡觀察下,DAPI染劑是利用紫外光波長的光線激發(fā)。單獨DAPI的大吸收波長為340nm,大發(fā)射波長為488nm;當DAPI與雙鏈DNA結合時,大吸收波長為364nm,大發(fā)射波長為454nm(10 mM Tris pH7.0,100 mM NaCl,10 mM EDTA),其發(fā)散光的波長范圍含蓋了藍色青綠色。DAPI也可以和RNA結合,但產生的熒光強度只有與DNA結合的熒光強度的1/5,其發(fā)散光的波長范圍約在500nm左右。

DAPI的配制及貯存

固體粉末:避光,2-8 ℃保存,3年沒有問題。

貯存液:用無菌水配制成濃度1 mg/ml的貯存液,配好后用錫紙包起來,避光,可在-20 ℃下長期保存。(DAPI易溶于水,在PBS中溶解度不高)

使用濃度:貯存液用1xPBS稀釋到終濃度100 ng/ml。

熒光封片液:0.5 mol/L碳酸鹽緩沖液與甘油等體積混合,pH9.5

染色與觀察:制好的玻片上滴加幾滴DAPI染液,染色10分鐘,流水沖去染液,濾紙吸除多余水分,加一滴熒光封片液,置于熒光顯微鏡下觀察,激發(fā)波長360-400nm。

注意事項:DAPI可能具有致癌性,全部操作過程中必須帶塑料或乳膠手套。

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