磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（PTA）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5465

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑四：臨用前取1支試劑四，加入0.6 mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復(fù)凍融（1支試劑四溶解后可做60S，為了延長試劑盒使用時間，此產(chǎn)品多給1支粉劑）。

產(chǎn)品說明：

磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（Phosphotransacetylase，PTA，EC 2.3.1.8）是與乙酸代謝相關(guān)的關(guān)鍵酶之一，乙酸在乙酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶的作用下生成乙酰輔*A，以此來連接糖類、脂肪、蛋白質(zhì)三大營養(yǎng)物質(zhì)的代謝通路-三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化。PTA催化乙酰輔*A和無機(jī)磷反應(yīng)生成輔*A和乙酰磷酸，該反應(yīng)促使DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB，其在412nm處有特征吸收峰。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、分析天平、低溫離心機(jī)、水浴鍋、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、可調(diào)節(jié)移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、冰、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。12000rpm，4℃離心10min，取上清置于冰上待測。

2. 細(xì)菌/細(xì)胞：按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌/細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎（功率200W，超聲3秒，間隔7秒，總時間5min）；然后12000rpm，4℃離心10min，取上清置于冰上待測。

二、測定步驟

1. 可見分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至412nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一于25℃預(yù)熱10min左右。

3. 操作表：

將上述試劑按順序加入微量玻璃比色皿/96孔板中，充分吸打混勻，記錄412nm波長下15秒時的初始吸光度A1，比色后迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起放入25℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)2分鐘（若酶標(biāo)儀帶有控溫功能，將溫度調(diào)至25℃）；迅速取出比色皿并擦干，記錄412nm波長下2分15秒時的吸光度A2，并計算ΔA測定=A2測定-A1測定，ΔA對照=A2對照-A1對照，ΔA=ΔA測定-ΔA對照。每個測定管需設(shè)置一個對照管。

三、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（PTA）活性計算

1. 使用微量玻璃比色皿測定：

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：25℃下每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。

PTA活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷（Cpr×V樣本）÷T=147.059×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本質(zhì)量計算

單位的定義：25℃下每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。

PTA活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷（W×V樣本÷V提?。?/span>÷T=147.059×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌/細(xì)胞計算

單位的定義：25℃下每10⁶個細(xì)菌/細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。

PTA活性（U/10⁶ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷（N×V樣本÷V提?。?/span>÷T=147.059×ΔA÷N

ε：TNB摩爾消光系數(shù)，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL； V樣本：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.05mL；V提取：加入提取液的體積，1mL；T：反應(yīng)時間，2min；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，以10⁶計。

2. 使用96孔板測定：

將上述公式中的d=1cm改為d=0.6cm（96孔板光徑）進(jìn)行計算即可。

注意事項：

1. 測定過程中樣本和所有試劑在冰上放置，以免變性和失效。

2. 最好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3. 樣本較多時，可根據(jù)樣本數(shù)量按操作表配制工作液（試劑一、二、三），因通過單位時間內(nèi)吸光值變化計算酶活，不推薦同時測多個樣本。

4. 如果樣本ΔA過低，可適當(dāng)加大樣本量后重新測定；如果樣本ΔA大于0.6（微量比色皿）或者0.4（96孔板），建議將樣本用提取液適當(dāng)稀釋后進(jìn)行測定。注意同步修改計算公式。

實驗實例：

1. 取0.1056g成熟梨果肉樣本，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，離心后取上清，按照測定步驟操作，用微量玻璃比色皿測得計算：ΔA測定=A2測定-A1測定=0.1013-0.0620=0.0393，ΔA對照=A2對照-A1對照=0.0571- 0.0558=0.0013，ΔA=ΔA測定-ΔA對照=0.0393-0.0013=0.0380，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

PTA活性（U/g 質(zhì)量）=147.059×ΔA÷W= 147.059×0.0380÷0.1056=52.919 U/g 質(zhì)量。

2. 取5.76×10⁶個細(xì)胞，加入0.8mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，離心后取上清，按照測定步驟操作，用微量玻璃比色皿測得計算：ΔA測定=A2測定-A1測定=0.2411-0.1402=0.1009，ΔA對照=A2對照-A1對照=0.1775-0.1037= 0.0738，ΔA=ΔA測定-ΔA對照=0.1009-0.0738=0.0271，按細(xì)胞數(shù)量計算酶活得：

PTA活性（U/10⁶ cell）=0.0271÷（13.6×10^-3×1）×0.2÷（5.76×0.05÷0.8）÷2=0.554 U/10⁶ cell。

參考文獻(xiàn)：

[1] Michael M, Karin B, Wolfgang S, et al. Isolation and properties of acetate kinase- and phosphotransacetylase- negative mutants of Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus [J]. Microbiology, 1995, 141(11): 2891-2896.

[2] Miyake M, Kataoka K, Shirai M, et al. Control of poly-beta-hydroxybutyrate synthase mediated by acetyl phosphate in cyanobacteria[J]. Journal of Bacteriology, 1997, 179(16): 009-5013.

[3] Bock AK, Glasemacher J, Schmidt R, et al. Purification and characterization of two extremely thermostable enzymes, phosphate acetyltransferase and acetate kinase, from the hyperthermophilic eubacterium Thermotoga maritima[J]. Journal of Bacteriology, 1999, 181(6): 1861-1867.

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