半胱氨酰亞砜裂解酶（CSL）活性檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號：BC5390

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：試劑放于試劑瓶內(nèi)EP管中。臨用前加入4 mL蒸餾水溶解，-20℃分裝可保存4周，避免反復(fù)凍融。

2、 試劑二工作液：臨用前根據(jù)樣本量將試劑二用蒸餾水稀釋5000倍，現(xiàn)用現(xiàn)配。

3、 標準品：20μmol/mL 丙酮酸鈉標準液。

4、 0.625μmol/mL丙酮酸鈉標準液的配制：臨用前取30μL的20μmol/mL 標準液于EP管中，加入930μL蒸餾水充分溶解，配制成0.625μmol/mL的丙酮酸鈉標準液備用。

產(chǎn)品說明：

半胱氨酰亞砜裂解酶，簡稱蒜酶，又名蒜氨酸酶。半胱氨酰亞砜裂解酶幾乎存在于所有蔥屬植物中，如大蒜，洋蔥，韭菜等。蒜氨酸酶存在于液泡內(nèi)，其天然底物蒜氨酸存在于細胞質(zhì)中；蒜氨酸酶與蒜氨酸接觸并催化產(chǎn)生蒜素和順、反式阿霍烯并生成丙酮酸和氨等副產(chǎn)物，也是大蒜等植物辛辣氣味的主要來源。

半胱酰胺亞砜裂解酶可以催化S-甲基-L-半胱*酸亞砜生成丙酮酸。丙酮酸可與2,4-二硝*苯肼反應(yīng)生成2,4-二硝*苯腙，在堿性條件下顯棕紅色；測定505nm吸光度的變化，即可計算CSL酶活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織樣本：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿，4℃浸提30分鐘。12000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2. 液體樣本：直接測定。(若溶液呈現(xiàn)渾濁，則離心取上清后再測定)。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至505nm，用蒸餾水調(diào)零。

2、操作表（1.5mLEP管內(nèi)操作）：

混勻，室溫放置10min，于1mL玻璃比色皿內(nèi)測定505nm波長處的吸光度。記作A_測定，A_對照，A_標準，A_標準空白。?A_測定=A_測定-A_對照，?A_標準=A_標準-A_標準空白。（標準管和標準空白管只需做1-2次。）

三、CSL活性計算

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：37℃，每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。

CSL活性（U/mg prot）=（?A_測定×C_標準÷?A_標準）×V_樣÷（V_樣×Cpr）÷T×F=0.0208×?A_測定÷?A_標準÷Cpr ×F

(2) 按樣本質(zhì)量計算

單位的定義：37℃，每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。

CSL活性（U/g 質(zhì)量）=（?A_測定×C_標準÷?A_標準）×V_樣÷（V_樣÷V_樣總×W）÷T×F=0.0208×?A_測定÷?A_標準÷W×F

(3) 按血清（漿）等液體體積計算

單位的定義：每mL血清（漿）等液體每分鐘催化產(chǎn)生1μmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。

CSL活性（U/mL）=（?A_測定×C_標準÷?A_標準）×V_樣÷V_樣÷T×F=0.0208×?A_測定÷?A_標準×F

C_標準: 丙酮酸鈉標準液的濃度，0.625μmol/mL；V_樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.1mL；V_樣總：加入的提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，30min；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；F：樣本稀釋倍數(shù)。

注意事項：

1. 如果測定結(jié)果?A_測定＞1，可以對樣本用蒸餾水進行稀釋或者縮短第一步反應(yīng)時間；吸光值較小，可以加大樣本量或者延長第一步反應(yīng)時間至1h或者更長時間。注意計算時同步修改計算公式。

2. 對于初次測定樣本，建議將樣本勻漿液用蒸餾水進行梯度稀釋后測定，選取最佳的稀釋倍數(shù)。洋蔥、香菇、大蒜類樣本建議直接稀釋4-10倍后再進行最佳稀釋倍數(shù)摸索。（實驗室洋蔥進行了8倍稀釋，蒜進行了64倍稀釋）

實驗實例：

1、 稱取0.1233g蒜樣本，加入提取液進行冰浴勻漿，對上清用蒸餾水稀釋64倍，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算?A_測定=A_測定-A_對照=0.689-0.184=0.505，?A_標準=A_標準-A_標準空白=0.738-0.026=0.712，帶入公式計算：

CSL活性（U/g 質(zhì)量）= 0.0208×?A_測定÷?A_標準÷W×F=7.658 U/g 質(zhì)量。

2、 稱取0.1263g洋蔥樣本，加入提取液進行冰浴勻漿，對上清稀釋4倍，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算?A_測定=A_測定-A_對照=0.66-0.411=0.249，?A_標準=A_標準-A_標準空白=0.738-0.026=0.712，帶入公式計算：

CSL活性（U/g 質(zhì)量）= 0.0208×?A_測定÷?A_標準÷W×F=0.230 U/g 質(zhì)量。

參考文獻：

[1] Su Qianqian, Tang Jing, Zhao Liyan, et al. Effects of nanocomposite packaging on the quality and formaldehyde content of shiitake mushrooms during storage [J]. Food Science, 2015(8):6.

[2] Kumagai H, ?Hidetoshi KONO, Sakurai H, et al. Comparison of C-S Lyase in Lentinus edodes and Allium sativum [J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2022(66): 2560–2566. 

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