果膠酶活性檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC2630

規(guī)格：50T/24S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：將試劑一A倒入試劑一B于50℃水浴中溶解（期間可拿出振蕩數(shù)次）。該試劑易長菌，配制完成后可-20℃分裝保存，可保存12周。

2、 標準品：10mg半乳糖醛酸。臨用前加入0.943mL蒸餾水，配成50μmol/mL的標準液。

產品說明：

果膠酶（pectinase）是分解果膠的酶類，包括原果膠酶，果膠酯酶，多聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶四大類，廣泛存在于高等植物果實和微生物中，是水果加工中最重要的酶。

果膠酶水解果膠生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸與DNS試劑反應生成在540nm有特征吸收峰的棕紅色物質，測定540nm處吸光值變化可計算得果膠酶活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、1mL玻璃比色皿、可調式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

2、菌類：按照細菌數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細菌（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

3、液體：直接檢測。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計預熱30min 以上，調節(jié)波長至540nm，蒸餾水調零。

2、 將50μmol/mL 標準液用蒸餾水稀釋為6、5、4、3、2、1 μmol/mL的標準溶液備用。

3、 取125μL樣本沸水浴10min備用。

4、 樣本測定（在1.5mL離心管中）：

三、果膠酶活性計算

1、 標準曲線的繪制：

以各個標準溶液的濃度為x軸，其對應的ΔA標準為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程y=kx+b，將ΔA帶入方程得到x（μmol/mL）。

2、 果膠酶活性的計算：

（1）按蛋白濃度計算

酶活定義：在50℃，pH3.5條件下，每毫克蛋白每小時分解果膠產生1μmol半乳糖醛酸為1個酶活力單位。

果膠酶活性（U/mg prot）=x×V提取÷（V提取×Cpr）÷T= 2x÷Cpr

（2）按樣本質量計算

酶活定義：在50℃，pH3.5條件下，每克樣本每小時分解果膠產生1μmol半乳糖醛酸為1個酶活力單位。

果膠酶活性（U/g 質量）= x×V提取÷W÷T=2x÷W

（3）按照細菌數(shù)量計算

酶活定義：在50℃，pH3.5條件下，每10⁴個細菌每小時分解果膠產生1μmol半乳糖醛酸為1個酶活力單位。

果膠酶活性（U/10⁴ cell）= x×V提取÷T÷細菌數(shù)量（萬個）=2x÷細菌數(shù)量（萬個）

（4）按液體體積計算

酶活定義：在50℃，pH3.5條件下，每mL樣本每小時分解果膠產生1μmol半乳糖醛酸為1個酶活力單位。

果膠酶活性（U/mL）= x×V樣÷V樣÷T= 2x

V提?。禾崛∫后w積，1mL； V樣：加入的樣本體積，0.125mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；T：反應時間：0.5h。

注意事項：

1、 A大于1.5時，建議將樣本用提取液稀釋后再進行測定。

2、 植物果實組織建議將樣本稀釋10倍或20倍后再測定。

實驗實例：

1. 0.1g獼猴桃加入1mL提取液進行冰浴勻漿，然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上稀釋10倍后按照測定步驟操作，測得計算ΔA= A測定管-A對照管=1.465-1.45=0.015，依據(jù)標準曲線y=0.2575x-0.2214，計

算得x=0.918μmol/mL，按樣本質量計算酶活得：

果膠酶活性（U/g質量）=2x÷W×10（稀釋倍數(shù)）= 183.6 U/g質量。

相關發(fā)表文獻：

[1] Yuxing Wu,Liangsheng Xu,Zhiyuan Yin,et al. Transcription factor VmSeb1 is required for the growth, development, and virulence in Valsa mali. Microbial Pathogenesis. October 2018;132-138.(IF2.581)

[2] Yuxing Wu,Liangsheng Xu,Zhiyuan Yin,et al. Two members of the velvet family,VmVeA and VmVelB,affect conidiation,virulence and pectinase expression in Valsa mali. Molecular Plant Pathology. November 2017;(IF4.379)

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