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| 品牌 | SOLARBIO/索萊寶 | CAS | 詳詢 |
|---|---|---|---|
| 分子式 | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
| 分子量 | 詳詢 | 貨號 | BC2425 |
| 規(guī)格 | 100T/96S | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
| 主要用途 | 磷脂酶C（PLC）檢測 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,綜合 |
磷脂酶C（PLC）活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。
貨號：BC2425
規(guī)格：100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液一 | 液體110 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液體0.6mL×2支 | -20℃保存 |
試劑一 | 液體110 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體15mL×1瓶 | -20℃保存 |
試劑三 | 液體10mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 液體1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液配制：
1．提取液二：試劑易揮發(fā)，用完后快速擰蓋，封口封纏口。
2．標(biāo)準(zhǔn)品：5μmol/mL對硝基苯*溶液。
3．提取液的配制：臨用前根據(jù)樣本量將提取液一與提取液二1:1混合，切勿一次性全部混合，用多少配多少。
產(chǎn)品說明：
磷脂酶C（EC 3.1.4.3）是一種水解甘油磷酸酯C3位點甘油磷酸酯鍵的脂類水解酶，廣泛存在于微生物及動植物的組織和細(xì)胞中，在細(xì)胞代謝、細(xì)胞傳遞、生長發(fā)育等方面具有重要作用。
磷脂酶C催化水解NPPC產(chǎn)生對硝基苯*，在410nm處有特征吸收峰。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋、超速冷凍離心機、可調(diào)式移液槍、天平、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、蒸餾水、冰。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
1、 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例加入提取液，建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液，冰浴勻漿后于4℃，10 000g離心5min；取全部上清再于4℃、100 000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。
2、 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后于4℃，10 000g離心5min；取全部上清再于4℃、100 000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。
3、 血清（漿）：直接測定。
二、測定步驟
1、 可見分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長到410nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。
2、 標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋：將5μmol/mL對硝基苯*溶液用蒸餾水稀釋至1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.02、0.01μmol/mL。
3、 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表：
序號 | 稀釋前濃度（μmol/mL） | 標(biāo)準(zhǔn)液體積（µL） | 蒸餾水體積（µL） | 稀釋后濃度（μmol/mL） |
1 | 5 | 125 | 375 | 1.25 |
2 | 1.25 | 200 | 200 | 0.625 |
3 | 0.625 | 200 | 200 | 0.3125 |
4 | 0.3125 | 200 | 200 | 0.15625 |
5 | 0.15625 | 200 | 200 | 0.078 |
6 | 0.078 | 200 | 200 | 0.039 |
7 | 0.039 | 200 | 200 | 0.02 |
8 | 0.02 | 200 | 200 | 0.01 |
備注：實驗中每個標(biāo)準(zhǔn)管需20µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。
4、 樣本測定：（在EP管或者96孔板中加入下列試劑）
試劑名稱 (μL) | 空白管 | 測定管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 |
標(biāo)準(zhǔn)品 | - | - | 20 |
樣本 | - | 20 | - |
試劑一 | 20 | - | - |
試劑二 | 100 | 100 | 100 |
充分混勻，37℃反應(yīng)30min | - | ||
試劑三 | 80 | 80 | 80 |
充分混勻后測定410nm處吸光值，分別記為A空白、A測定和A標(biāo)準(zhǔn)，ΔA=A測定管-A空白管，ΔA標(biāo)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。標(biāo)準(zhǔn)曲線和空白管只需做1-2次。 | |||
三、酶活計算
1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線：
以標(biāo)準(zhǔn)品濃度（x，μmol/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度ΔA標(biāo)（y）為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA帶入公式中計算濃度x（μmol/mL）。
2、 酶活測定：
（1）按蛋白濃度計算
酶活定義：每毫克蛋白每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對硝基苯*所需的酶量為一個酶活力單位。
PLC活性 (U/mg prot) = x×V樣÷(V樣×Cpr) ÷T = 0.033× x÷ Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計算
酶活定義：每克組織每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對硝基苯*所需的酶量為一個酶活力單位。
PLC活性 (U/g 質(zhì)量) = x×V樣總÷W÷T = 0.033× x÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算
酶活定義：每104個細(xì)胞每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對硝基苯*所需的酶量為一個酶活力單位。
PLC活性(U/104 cell）= x×V樣總÷細(xì)胞數(shù)量÷T= 0.033× x÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按血清（漿）體積計算：
酶活定義：每毫升血清每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對硝基苯*所需的酶量為一個酶活力單位。
PLC活性（U/mL）= x÷T = 0.033× x
V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入的試劑一體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；細(xì)胞數(shù)量：以萬計；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；T：反應(yīng)時間，30min。
相關(guān)系列產(chǎn)品：
BC2410/BC2415 磷脂酶D（PLD）活性檢測試劑盒
BC2430/BC2435 磷脂酶A2（PLA2）活性檢測試劑盒
磷脂酶C（PLC）檢測試劑盒 微量法 磷脂酶C（PLC）檢測試劑盒 微量法
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